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PCR 擴(kuò)增必看：讓你的「引物設(shè)計(jì)」少走彎路
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作者:201321492800086
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發(fā)布時(shí)間: 2511天前
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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡稱 PCR）是一種體外快速擴(kuò)增特定基因或 DNA 序列的方法。由美國科學(xué)家 PE Cetus 公司遺傳部的 Dr. Mullis 發(fā)明并獲得了 1993 年化學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡稱 PCR）是一種體外快速擴(kuò)增特定基因或 DNA 序列的方法。由美國科學(xué)家 PE Cetus 公司遺傳部的 Dr. Mullis 發(fā)明并獲得了 1993 年化學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)。
PCR 技術(shù)目前是分子生物學(xué)研究中使用最多、最廣泛的手段之一，而引物設(shè)計(jì)是 PCR 技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不適合的 PCR 引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，比如表現(xiàn)為特異性差，擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），無條帶或條帶弱，等等。
PCR 引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板 DNA 序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到 PCR 的特異性與成功與否。
現(xiàn)在 PCR 引物設(shè)計(jì)大都通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行。可以直接提交模板序列到某指定網(wǎng)頁，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。一般來說，專門進(jìn)行 PCR 引物設(shè)計(jì)的專業(yè)軟件功能更為強(qiáng)大，但使用起來卻不太容易。
引物的設(shè)計(jì)可以參考一下 10 條設(shè)計(jì)原則：
1、引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過 70% 或有連續(xù) 8 個(gè)互補(bǔ)堿基同源；
2、某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū) DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì) mRNA 的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板；
3、寡核苷酸引物長度為 15～30bp，一般為 20～27bp，引物的有效長度>38 時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過 Taq DNA 聚合酶的最適溫度（74℃)，不能保證產(chǎn)物的特異性；
4、G+C 含量一般為 40%～60%。其 Tm 值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50% 寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于 Tm 值 5～10℃；
5、引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3′端不應(yīng)超過 3 個(gè)連續(xù)的 G 或 C，因這樣會(huì)使引物在 G+C 富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)；
6、引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合；
7、兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免 3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對(duì)引物間不應(yīng)多于 4 個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性；
8、引物的延伸是從 3′端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的 PCR（AS-PCR）反應(yīng)中，引物 3′端不能發(fā)生錯(cuò)配；
9、引物的 5′端限定著 PCR 產(chǎn)物的長度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性；
10、密碼子的簡并：如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物 3′端不要終止于密碼子的第 3 位，因密碼子的第 3 位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。
儀器的升降溫速度，控溫的準(zhǔn)確性及均一性、儀器的性能等因素可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。TurboCycler2 是臺(tái)灣 Blue-Ray 研發(fā)的一款 PCR 儀，基于提高PCR效率和精準(zhǔn)度的理念設(shè)計(jì)，7英寸的電容式觸摸屏和友好的用戶操作界面大大提高了操作直觀性。高達(dá) 5.5℃/sec 的升溫速率，極佳的準(zhǔn)確性和一致性，還可以設(shè)置一系列不同的溫度梯度。有可選 Wi-Fi 模塊，搭配手機(jī)遠(yuǎn)程監(jiān)控實(shí)驗(yàn)狀態(tài)，即時(shí)掌握實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。TurboCycler2快速升溫速度和精確的溫度控制保證了PCR優(yōu)良效率。
PCR 產(chǎn)物的質(zhì)控也是不可或缺的部分，關(guān)乎到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的正常運(yùn)行。傳統(tǒng)的凝膠電泳存在很多人為弊端，目前市面上多使用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀如 Qsep100 或 Qsep1 檢測(cè)，該系列儀器檢測(cè)靈敏度高，分辨率高，在 500bp 以內(nèi)最佳分辨率可達(dá) 1-4bp。無需制膠、染色、加樣、拍照等步驟，也不需熒光標(biāo)記，只需將待檢測(cè)樣本放于儀器樣品盤，全自動(dòng)上樣電泳出結(jié)果。1-96 或 1-8 個(gè)樣本靈活上樣，數(shù)據(jù)分析簡便靈活。可節(jié)約科研工作者的時(shí)間，提高科研工作者的實(shí)驗(yàn)效率，更避免了科研工作者與核酸染料的接觸，提供更為方便快捷的科研服務(wù)。
PCR 技術(shù)目前是分子生物學(xué)研究中使用最多、最廣泛的手段之一，而引物設(shè)計(jì)是 PCR 技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不適合的 PCR 引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，比如表現(xiàn)為特異性差，擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），無條帶或條帶弱，等等。
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引物的設(shè)計(jì)可以參考一下 10 條設(shè)計(jì)原則：
1、引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過 70% 或有連續(xù) 8 個(gè)互補(bǔ)堿基同源；
2、某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū) DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì) mRNA 的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板；
3、寡核苷酸引物長度為 15～30bp，一般為 20～27bp，引物的有效長度>38 時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過 Taq DNA 聚合酶的最適溫度（74℃)，不能保證產(chǎn)物的特異性；
4、G+C 含量一般為 40%～60%。其 Tm 值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50% 寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于 Tm 值 5～10℃；
5、引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3′端不應(yīng)超過 3 個(gè)連續(xù)的 G 或 C，因這樣會(huì)使引物在 G+C 富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)；
6、引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合；
7、兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免 3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對(duì)引物間不應(yīng)多于 4 個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性；
8、引物的延伸是從 3′端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的 PCR（AS-PCR）反應(yīng)中，引物 3′端不能發(fā)生錯(cuò)配；
9、引物的 5′端限定著 PCR 產(chǎn)物的長度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性；
10、密碼子的簡并：如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物 3′端不要終止于密碼子的第 3 位，因密碼子的第 3 位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。
儀器的升降溫速度，控溫的準(zhǔn)確性及均一性、儀器的性能等因素可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。TurboCycler2 是臺(tái)灣 Blue-Ray 研發(fā)的一款 PCR 儀，基于提高PCR效率和精準(zhǔn)度的理念設(shè)計(jì)，7英寸的電容式觸摸屏和友好的用戶操作界面大大提高了操作直觀性。高達(dá) 5.5℃/sec 的升溫速率，極佳的準(zhǔn)確性和一致性，還可以設(shè)置一系列不同的溫度梯度。有可選 Wi-Fi 模塊，搭配手機(jī)遠(yuǎn)程監(jiān)控實(shí)驗(yàn)狀態(tài)，即時(shí)掌握實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。TurboCycler2快速升溫速度和精確的溫度控制保證了PCR優(yōu)良效率。
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