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多重降落 PCR (MT-PCR)： PCR 新應(yīng)用成就更好的精確性和穩(wěn)定性
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作者:201321492800086
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發(fā)布時(shí)間: 2868天前
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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，或稱之為 PCR，已使用近 30 年，在各種生化和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室均有應(yīng)用。然而，PCR 最突出的問題是非靶 DNA 擴(kuò)增，導(dǎo)致各種問題，尤其是假陽性結(jié)果。幸好多年來 PCR 技術(shù)在不斷進(jìn)步，發(fā)展出一種新型 PCR 技術(shù)——多重降落 PCR（MT-PCR）。MT-PCR 結(jié)合了多重 PCR 和降落 PCR 的特征。在一項(xiàng) PCR 實(shí)驗(yàn)中，采用了多種引物檢驗(yàn)多重 DNA 靶標(biāo)。每個(gè)周期的退火溫度從原設(shè)定溫度降低 0.5～1°C，直到達(dá)到最佳退火溫度。
MT-PCR 是什么?
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，或稱之為 PCR，已使用近 30 年，在各種生化和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室均有應(yīng)用。然而，PCR 最突出的問題是非靶 DNA 擴(kuò)增，導(dǎo)致各種問題，尤其是假陽性結(jié)果。幸好多年來 PCR 技術(shù)在不斷進(jìn)步，發(fā)展出一種新型 PCR 技術(shù)——多重降落 PCR（MT-PCR）。MT-PCR 結(jié)合了多重 PCR 和降落 PCR 的特征。在一項(xiàng) PCR 實(shí)驗(yàn)中，采用了多種引物檢驗(yàn)多重 DNA 靶標(biāo)。每個(gè)周期的退火溫度從原設(shè)定溫度降低 0.5～1°C，直到達(dá)到最佳退火溫度。
MT-PCR，出現(xiàn)在 2016 年*的一項(xiàng)新研究中（1），發(fā)展該技術(shù)旨在檢測(cè)抗性基因。MT-PCR 成功地識(shí)別出數(shù)個(gè)不同的靶細(xì)菌 DNA，還阻止非靶 DNA 擴(kuò)增反應(yīng)，從而阻止假陽性結(jié)果。
MT-PCR 如何解決多重 PCR 面臨的問題？
常規(guī) PCR 試驗(yàn)的目標(biāo)是單個(gè) DNA 模板，特定的引物會(huì)在 20 個(gè)反應(yīng)周期內(nèi)將模板擴(kuò)增。在一個(gè)反應(yīng)中采用多個(gè)引物和靶 DNA，可節(jié)省大量時(shí)間，還能同時(shí)在一個(gè) PCR 中擴(kuò)增多個(gè)靶 DNA*(2)。
但是，多重 PCR 有一個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn)，很難在引物和 DNA 混合物中避免非靶 DNA 交叉擴(kuò)增。因此，進(jìn)行多重 PCR 前，我們必須提前選擇特定的靶 DNA。只選擇不同 DNA 配對(duì)長(zhǎng)度的靶 DNA 進(jìn)行多重 PCR。
雖然，多重 PCR 節(jié)省時(shí)間，但仍無法避免非靶 DNA 交叉擴(kuò)增導(dǎo)致的錯(cuò)誤。因此，我們需要 MT-PCR。MT-PCR 和多重 PCR 的主要差別在于退火溫度。MT-PCR 的退火溫度隨每個(gè)周期降低。設(shè)定的第一個(gè)周期（起始）退火溫度比預(yù)期溫度高 3～5°C 。一般而言，退火溫度越高，引物和模板匹配越好。緩慢降低退火溫度讓 PCR 更有效。
精確而穩(wěn)定地控制溫度至關(guān)重要
本項(xiàng) MT-PCR 研究的研究者在血液培養(yǎng)瓶和加標(biāo)血液瓶中成功地識(shí)別了 5 個(gè)靶 DNA，mecA, Blashv, Blactx-M, BlaTem 和 Blaoxa，參見圖 1。同時(shí)，沒有交叉擴(kuò)增和假陽性結(jié)果。（圖 2），試驗(yàn)中，在熱循環(huán)儀上設(shè)定的起始退火溫度為 66℃，30 秒。研究者將反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，但是每個(gè)周期退火溫度降低 0.5℃。溫度控制的精確性和穩(wěn)定性非常重要。BlueRay Biotech 生產(chǎn)的 TurboCycler2 熱循環(huán)儀非常穩(wěn)定，可精確而穩(wěn)定地控制溫度。該儀器的升降溫速度快，可迅速設(shè)定需要的特定溫度。還有一個(gè)樣品模式，將樣品和受試塊的溫差控制在最小絕對(duì)值。TurboCycler2 是研究者進(jìn)行 MT-PCR 的理想選擇。
圖. 1
圖 1 來自 12 個(gè)加標(biāo)血液培養(yǎng)瓶的樣品的 MT-PCR 結(jié)果。第 9～第 13 是靶基因的對(duì)照組。第 1～第 8 明確顯示靶基因在 MT-PCR 陣列中表達(dá)，且無其他交叉擴(kuò)增。
圖 2. 來自 33 個(gè)陽性血液培養(yǎng)瓶的樣品在 4 h MT-PCR 陣列的結(jié)果。明確顯示靶基因，且無非靶基因表達(dá)。
在本項(xiàng)研究中，靶細(xì)菌 DNA 含有多重抗生素耐藥性基因。被這些細(xì)菌感染的患者要及時(shí)接受正確的抗生素治療，否則敗血癥會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。該項(xiàng)研究工作證明，MT-PCR 可迅速鑒別有關(guān)細(xì)菌。
結(jié)論
MT-PCR 不但可以迅速識(shí)別樣品中多個(gè)靶細(xì)菌的基因，而且，還可以避免非靶 DNA 交叉擴(kuò)增。與以往相比較，假陽性結(jié)果明顯更少，這對(duì)臨床研究和診斷具有重大意義。我們希望不久的將來，MT-PCR 有更多的應(yīng)用。為取得最佳 PCR 結(jié)果，選擇一個(gè)優(yōu)秀的熱循環(huán)儀也是非常重要的。
參考文獻(xiàn)：
1. Ming-Yi W, Jian-Li G, Ying-Jian C, Yu S, Mei S, Hai-Zhu L and Cheng-Kin H.
Direct Detection of mecA, blaSHV, blaCTX-M, blaTEM, and blaOXA Genes from Positive Blood Culture Bottles by Multiple-touchdown PCR Assay.
2. Henegariu O, Heerema N A, Dlouhy, S R, Vance, G H and Vogt, P H (1997) Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. Biotechniques 23, 504-511.
