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實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)「新應(yīng)用」
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作者:201321492800086
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發(fā)布時間: 2785天前
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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，英文簡稱 PCR，是一種特殊的擴(kuò)增放大特定 DNA 片段的分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，可以通過瓊脂糖凝膠電泳或者現(xiàn)在非常流行的毛細(xì)管電泳系統(tǒng)來進(jìn)行定性分析，但是電泳只可以對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析，沒有辦法知道 PCR 體系中模板 DNA 的起始拷貝數(shù)。目前分子生物學(xué)中所研究的對象都是在組織或細(xì)胞中未進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的基因表達(dá)量和拷貝數(shù)，即起始模板量。在這種實(shí)驗(yàn)要求之下，實(shí)時熒光定量 PCR 就體現(xiàn)了它的價值。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，英文簡稱 PCR，是一種特殊的擴(kuò)增放大特定 DNA 片段的分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，可以通過瓊脂糖凝膠電泳或者現(xiàn)在非常流行的毛細(xì)管電泳系統(tǒng)來進(jìn)行定性分析，但是電泳只可以對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析，沒有辦法知道 PCR 體系中模板 DNA 的起始拷貝數(shù)。目前分子生物學(xué)中所研究的對象都是在組織或細(xì)胞中未進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的基因表達(dá)量和拷貝數(shù)，即起始模板量。在這種實(shí)驗(yàn)要求之下，實(shí)時熒光定量 PCR 就體現(xiàn)了它的價值。
實(shí)時熒光定量 PCR 是在 PCR 指數(shù)擴(kuò)增期通過檢測熒光信號強(qiáng)度變化來實(shí)時定量 PCR 產(chǎn)物，據(jù)此計算樣本中的起始模板量或拷貝數(shù)。目前實(shí)時熒光定量 PCR 常用兩種方法，即 SYBR 染料法和 Taqman 探針法。SYBR 染料法是在 PCR 體系中添加過量的 SYBR Green 熒光染料，在 PCR 擴(kuò)增過程中，SYBR 熒光染料會滲入 DNA 雙鏈中，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光信號越來越強(qiáng)，而不摻入 DNA 雙鏈中的 SYBR 染料，則不會發(fā)出熒光。通過監(jiān)測熒光信號的強(qiáng)度，可以對 PCR 產(chǎn)物定量，進(jìn)而計算初始模板量。而 Taqman 探針法，是在 PCR 體系中加入一對引物同時加入一個特異性熒光探針，這個探針兩端分別帶有一個熒光基團(tuán)和一個淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針完整時，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光會被淬滅基團(tuán)吸收。
在 PCR 擴(kuò)增過程中，Taq 酶的 5’-3’外切酶活性會將探針降解，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，每形成一個 DNA 分子，就會出現(xiàn)一個熒光分子，進(jìn)而完成熒光信號的積累，通過監(jiān)測熒光信號的強(qiáng)度，可以對 PCR 產(chǎn)物定量，進(jìn)而計算初始模板量。在實(shí)時熒光定量 PCR 中涉及兩個很重要的概念，分別是熒光閾值和 Ct 值。其中熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，他可以設(shè)置在擴(kuò)增曲線的任意位置。而 Ct 值就是指每個反應(yīng)體系中熒光信號達(dá)到閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
實(shí)時熒光定量 PCR 對熒光信號的檢測非常靈敏，實(shí)驗(yàn)人員微小的手工加樣誤差會被級聯(lián)放大，熒光信號值差異較大，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不好，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和嚴(yán)謹(jǐn)性。基于此，實(shí)時熒光定量 PCR 非常需要標(biāo)準(zhǔn)化和均一化的實(shí)驗(yàn)流程來避免人為操作帶來的誤差，少量樣本必須得到準(zhǔn)確一致的處理，所以專門應(yīng)用于實(shí)時熒光定量 PCR 體系構(gòu)建的自動移液工作站就誕生了。
EzMate 401/601，是臺灣 Arise Biotech 研發(fā)的一款高精度自動移液設(shè)備，專門為 PCR/qPCR 樣本準(zhǔn)備而設(shè)計。操作簡單，1/8 通道任意更換，4-6 個標(biāo)準(zhǔn)微量滴定管/吸頭架區(qū)和 2 個試劑區(qū)，適配器多樣，適合不同實(shí)驗(yàn)室器具。成本低，體積小，便于檢修。準(zhǔn)確精密，最低可完成 1μL 準(zhǔn)確移液，同人工移液相比，重復(fù)性更好，精密度更高，是替代手工移液操作的最佳之選。
